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在生物课本中，有一个重点知识，老师总会特别强调，

“RNA是单链，不稳定，容易降解”。

但RNA凭借灵敏度高、特异性好等特点在病原体检测中愈加普及，因此大家越来越关注RNA的保存条件以及在不同样本中的稳定性差异，目前已经批准上市的HBV RNA检测试剂盒中标注的保存条件为-20℃3个月，-80℃长期。最近有研究显示，HBV RNA能够在采血之后的48小时内，于4℃或者25℃稳定保存，-20℃及-80℃保存的样本可反复冻融4次。

方法：
收集来自 40 名HBV DNA 复制依然活跃的慢性乙型肝炎感染患者的血液，在 2 小时内收集和处理。每个患者的血浆被分开并储存在 4°C 和 25°C（室温）以及六种不同的储存时间（0、2、6、12、24 和 48 小时），随后转移至-80°C 储存。使用10个患者的血浆对-20°C~25°C或-80°C~25°C多次冷冻循环的效果进行评估，同时使用数字聚合酶链反应 (dPCR)方法对样品中pgRNA 进行定量。有关pgRNA的差异，比较基线和每个时间点的水平方程(GEE)。定义pgRNA 的变化大于 0.5 log10 拷贝/mL 被视为具有临床意义。

结果：
最初收集的血浆样本中的平均HBV pgRNA水平为 5.58log10拷贝/mL（范围从3.08 到8.04 log10拷贝/mL）。平均 pgRNA水平与初始参考样本浓度相比，在不同时间段存储的样本与基线相比，均存在不同程度的减少。储存 6、12、24 和48 小时的pgRNA水平分别减少−0.05 log10拷贝/mL（95% 置信区间 (CI) −0.095 至 −0.005，p = 0.03)；−0.075 log10拷贝/mL (95% CI [−0.12至−0.03], p=0.001)；−0.084 log10拷贝/mL（95% CI [−0.13 至 −0.039]，p < 0.001）以及 −0.120 log10 拷贝/mL（95%CI [−0.17 至 −0.076]，p < 0.001）(图1)。但是，这些改变均小于0.5 log10 拷贝/mL，在定量允许范围内。相比保存在4°C或者25 °C，样品中pgRNA水平也没有显著的差异变化（−0.01 log10 拷贝/mL；95% CI [−0.708 ~0.689]，p = 0.98）(图2)。

图1：HBV pgRNA与基线相比的降幅

注释：HBV pgRNA的平均值（+/- 1SE）储存在4°C或25°C 的血浆中的水平。在 2、6、12、24 和 48 小时测量 HBV pgRNA 载量，以 log10拷贝/mL 表示。圆圈表示4°C存储，方块表示25°C存储。

图 2 ：HBV pgRNA 随时间和温度的降解

注释：HBV pgRNA的平均值（+/- 1SE）储存在4或25°C的血浆中的水平。在2、6、12、24和48小时测量HBV pgRNA载量，以log10拷贝/mL表示。三角形表示4°C存储，圆圈表示 25°C存储。

接着，研究对 -20°C 和 -80°C的温度条件下进行四次冻融循环。结果显示，无论是-20°C~25℃还是-80 °C~25℃的反复冻融，均不会影响HBV RNA在样本中的稳定性（图3）。

图3：在 −20°C 和 −80°C 下多次冻融循环后的 HBV pgRNA 浓度

注释：均值(+/-1SE) 的 HBV pgRNA 水平，表示为 log10 拷贝/mL，测量多达四次冻融周期。三角形和圆圈分别表示在-80 °C 和-20 °C 下的储存。

如此看来，HBV RNA实际上比我们比想象中的更加稳定，这是因为存在于血清中的HBV RNA是有蛋白质外壳包裹的，因此能够在室温保存一段时间（图4）。

图4：HBV RNA在血清中的存在形式

不仅仅是HBV RNA ，更多的研究还揭示了其他种类的RNA 在不同保存条件下的差异，例如HCV RNA，有研究证实其可以在4℃的条件下最长保存168h（7天），与基线数据相比，7天后的浓度变化仅为0.467 log10 拷贝/mL（5.025 vs. 5.492），但是如果进行5次从-80℃到25℃的反复冻融，样本浓度出现显著差异（4.454 vs.5.492），结合前面的数据。提示反复冻融4次可能是极限。另外还有研究提示，在设置的6个不同温度条件下，

1）25℃，5天

2）4℃，5天

3）-20℃，5天

4）-80℃，5天

5）4℃，6个月

6）-80℃，6个月

样本不能在室温下放置5天（1），不能在4℃放置6个月（5），其余4个温度条件均可，结合前面的数据推测，RNA在室温存放的极限可能为3-4天。

总而言之，通过以上种种数据，表明RNA比我们想象中更加稳定，而更多的一些个性化的保存条件还有待进一步的考察验证。
参考文献：

1. Rattanachaisit, Pakkapon et al, ‘Stability of Hepatitis B Virus Pregenomic RNA in Plasma Specimens Under Various Temperatures and Storage Conditions’ (2021) 9 PeerJ (San Francisco, CA) e11207

2. Halfon, Philippe et al, ‘Impact of Various Handling and Storage Conditions on Quantitative Detection of Hepatitis C Virus RNA’ (1996) 25(3) Journal of hepatology 307

3. Gessoni, G et al, ‘The Stability of Hepatitis C Virus RNA after Storage at +4 Degrees C’ (2000) 7(4) Journal of viral hepatitis 283